外泌体实验过程中的那些事

实验的成败取决于很多因素，一些小的细节方面往往决定着整个实验的结果走向，今天和大家分享下，在外泌体的提取以及鉴定的过程中的一些注意事项，欢迎大家一起讨论。

一、样本收集注意事项

首先是样本的采集工作，不同的实验样本采集时需要注意的地方也是不一样的，下面跟大家分享几种常见样本的注意事项。

1.细胞上清

细胞培养上清在收集样本前，需换成无外泌体血清进行培养，在细胞培养过程中，我们需要注意培养时间、污染、细胞死亡率及FBS等问题。在细胞的培养过程中肯定是不允许有污染的，但有些培养细胞可能本身带有病毒基因组，在培养过程中会释放出病毒颗粒，这就要衡量病毒颗粒是否会影响后续实验。一般细胞培养24-48h后即可分离外泌体，在特殊情况下，如在培养基中添加特殊的化学物质，培养15-60min即可收集。因为细胞死亡会分泌小体，所以在研究外泌体时细胞的死亡率一定要控制在 5% 之内。另外，未经处理的FBS中含有大量的外源外泌体，所以细胞培养一定要用经过处理不含外泌体的FBS。

2.血液

在外泌体的血样研究中，要注意采集针针头的大小，因为在抽血过程中，血液流经针头的时候会产生剪切力，如果针头太细，剪切力会较大，会使细胞破碎或刺激血小板分泌外泌体，从而影响后续的实验。有研究表明，21号针头的大小比较合适作为外泌体研究的血样收集。其他方面，例如：采血的位置，人的生理周期，饮食周期及时间周期（24h）等都会对样品中的外泌体有一定的影响。所以取样的时候尽量做到定点定时。最后还需注意，尽量在采血30min内处理样本，因血液收集在收集管中时，血细胞和血小板还会分泌外泌体。此外，血浆样本在采集时一定不能用肝素抗凝管

3.尿样

尿液在收集时需要添加抑菌剂，在尿液的取样中，性别、年龄、进食等都会有一定的影响，还有一个特殊的点是尿液的新鲜程度，这个新鲜度指的是尿液在膀胱中存在的时间。

二、样本的保存与运输

在日常的工作中，我们经常会收到这样的问题：

（1）我在甘肃，样本寄到上海这边做检测，可以吗？

（2）我的样本可以用冰块运输吗？

（3）我是2个月前提取的外泌体，一直放-80℃，还可以做NTA吗？

（4）我的外泌体放在4℃ 1周了，还能做检测吗？

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样本现提现测当然是**的，但是，很多伙伴不得不面临一个问题，就是样本保存及运输问题，通过翻阅文献我们发现，存放不同时间、不同温度，对不同的外泌体样本影响不一，一般短时间（一周内），4度保存，长时间的话放-20或者-80；我们在运输中也要尽量降低影响，在外泌体提取前，如果是培养上清样本，需要将收集好的培养液干冰保存运输；如果是血清或者是血浆样本，血清血浆干冰保存运输，全血加抗凝冰袋运输；提取好的外泌体一般干冰进行运输。

三、样本的检测

1.外泌体粒径检测—NTA

提取完外泌体，就要进行相关的各项检测了，粒径颗粒跟踪分析—NTA，是对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析，结合Stockes-Einstein方程式计算出纳米颗粒的流体力学直径和浓度，检测10nm-1000nm范围内的颗粒。NTA技术已被外泌体研究领域认可为外泌体表征手段之一，相较于其他表征方式，NTA技术的样本处理更简单、更能保证外泌体原始状态、检测速度更快。

进行检测的外泌体一般采用干冰进行运输；检测所需的样本量与样本本身浓度有关，例如：样本较浓，则用量小，反之则多，如果已经有全蛋白量的数据，可以算出大概的送样量。根据检测的经验，样本取用量一般在2µl-100µl，取用量大于50µl时，大多是由于样本分泌量过低、提取失败或者对样本有过多稀释。因此，一般建议送样量30µl—50µl。

2. 外泌体鉴定—透射电镜

   通过透射电镜，可以确定外泌体的大小及形态特征，准备好的外泌体样本要使用2.5%的戊二醛进行固定，2.5%的戊二醛的量不要太多，100μL-200μL即可，保证外泌体的浓度便于观察寻找，提取好的外泌体用冰袋进行运输。

3. 外泌体鉴定—WB

WB的检测大家都很熟悉了，但是在这个实验过程中，往往会出现很多小的问题，今天跟大家分享下：

（1）电泳中常出现的一些现象:

a. 条带呈笑脸状，可能因为凝胶不均匀冷却，中间冷却不好，电泳系统温度偏高等。

b. 条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。

c. 拖尾，可能是样品溶解不好。

d. 纹理(纵向条纹)，可能是样品中含有不溶性颗粒。

e. 条带偏斜，可能电极不平衡或者加样位置偏斜。

f. 条带两边扩散，可能加样量过多。

（2）WB结果中背景较高

a. 膜封闭不够，可以延长封闭的时间或者选择更加适合的封闭液。

b. 抗稀释度不适宜，可以对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。

c. 抗孵育的温度偏高，建议4℃结合过夜。

d. 选择的膜容易产生高背景，一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF膜低。

e. 膜在实验过程中干过，在实验过程中要注意保持膜的湿润。

f. 检测时曝光时间过长，减少曝光时间。

（3）WB结果中杂带较多

a. 目的蛋白有多个修饰位点(磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等)，本身可以呈现多条带。可以查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。

b. 目的蛋白有其它剪切本，查阅文献或生物信息学分析可能性。

c. 样本处理过程中目的蛋白发生降解，加入蛋白酶抑制剂或样本处理时在冰上操作。

d. 上样量过高，太敏感，可以适当减少上样量。

e. 一抗特异性不高，可以重新选择或制备高特异性的抗体。

f. 一抗不纯，纯化抗体。

g. 一抗或者二抗浓度偏高，降低抗体浓度。

（4）WB结果中无信号或显示信号弱

a. 检测样本不表达目的蛋白，选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。

b. 检测样本低表达目的蛋白，提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。

c. 转移不完全或过转移，可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头，适当调整转膜的时间和电流。

d. 抗体不能识别测试种属的相关蛋白，购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。

e. 一抗孵育时间不足，建议4℃结合过夜。

f. 二抗与一抗不匹配，选择针对一抗来源的种属的抗体。

g. 洗膜过度，洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。

（5）其它现象:

a. 膜上多处出现黑点或黑斑，可能是抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。

b. 反白(条带显白色)，可能是目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高。

c. 蛋白分子量偏低或偏高，可能是胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶，小分子蛋白要用高浓度胶。

4. 外泌体鉴定—外泌体荧光标记

对分离的外泌体进行体外标记或活体示踪，有助于对外泌体的功能进行进一步的研究。目前对于外泌体的标记方法有很多种，包括亲脂性的染料和膜渗透型的化合物等。要选择合适的亲脂性染料，例如：PKH-67(green)/PKH-26(red)，染料可以稳定的与细胞膜脂质区结合并发出荧光，主要用于细胞体外标记、体外细胞增殖研究以及体内外的细胞失踪研究。PKH67的体内荧光半衰期为10-12天。相比于PKH-67，PKH-26有更长的半衰期，标记在兔红细胞上的PKH26半衰期长达100天以上。特别适用于体外增殖研究以及长期的体内细胞跟踪研究。

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