如何做好外泌体实验?需要做好哪些步骤?

　　在生物学领域，越来越多的人开始关外泌体实验。可以说，这个实验有着很重要的意义。那么，我们如何做好外泌体实验?需要做好哪些步骤?下面，我们来了解一下。

　　1.分离：

　　超速离心：

　　超速离心是外泌体分离常用的技术之一。据不完全统计，大约有1/2的研究人员会选择这种方法来分离外泌体。该方法包括几个离心步骤，可以逐步去除细胞，细胞碎片和大囊泡，并沉淀外泌体。但是，这种方法对于诸如血浆和血清之类的粘性生物流体并不有效，并且反复离心操作可能会损害外泌体并降低其质量。

　　超速离心结合蔗糖溶液和梯度密度离心可以获得纯度更高的外泌体，这被认为是纯度非常高的分离方法。然而，该方法对离心时间非常敏感，通常需要8-30小时，且收率低。它也不适用于血浆和血清等粘性生物流体中外泌体的分离，因此很难广泛传播。

　　聚合物沉淀法：

　　第二种流行的外泌体分离技术是基于聚合物的沉淀。常见的聚合物是聚乙二醇(PEG)。通常将含聚合物的沉淀溶液与生物液体混合，在4°C下孵育，然后低速离心以沉淀外泌体。随着产品的不断更新，提取效率和提纯效果逐渐提高，从而逐渐取代了超速离心法并得到了推广。沉淀法的主要缺点是分离物中存在少量的聚合物。但是不用担心。通常，这些物质不会干扰下游分析。越来越多的杂志也认识到使用商业试剂盒提取外泌体。

　　2、鉴定：

　　外泌体的鉴定是隔离后困扰研究人员的另一个问题。

　　有三种识别方法：1.形态(电子显微镜); 2.粒度(直径分析); 3.标记的蛋白质(WB)。简而言之，TEM可以清楚地看到外来体的大小和形态，这是鉴定方法中的金标准。其他两种方法通常用作辅助方法。

　　3、得到了外泌体之后如何做?

　　外泌体携带大量功能性miRNA，少量mRNA，lncRNA和特定蛋白质(例如细胞因子，生长因子)和其他生物活性物质，这些物质参与细胞通讯，细胞迁移，血管生成和其他肿瘤生理过程。与各种疾病的发生和发展密切相关。一旦确定了外分泌经验，就可以在蛋白质和核酸水平上对其进行深入测试和分析。

　　在此必须注意，由于外泌体包含许多降解的短RNA片段，因此测序将是背景干扰的有效数据。通常建议使用微阵列方法检测外泌体miRNA。对于lncRNA，它们中的大多数在细胞中表达不足，而外泌体中的丰度较低。对于低丰度基因，微阵列检测比测序准确得多，因此也建议使用基因芯片方法检测外显子lncRNA。