基于DNA扩增反应鉴定乳腺癌PD-L1阳性外泌体

　　PD-L1阳性外泌体与乳腺癌的进展和免疫治疗反应相关，在液体活检中潜力巨大。来自外泌体实验的人员建立了一种基于DNA扩增反应的金属有机框架PVP@HRP@ZIF-8，并通过电化学传感方法初次实现量化乳腺癌患者血液样本中的PD-L1阳性外泌体，并揭示了PD-L1阳性外泌体水平与乳腺癌预后之间的潜在关联。

　　细胞分泌的外泌体是一种细胞外囊泡，通过细胞内运输途径产生，并从细胞膜释放后广泛分布在体液中(尤其是血液)。纳米大小的囊泡包含典型的磷脂双层结构，并携带大量源自原始细胞的生物分子。通常，分泌细胞的外泌体参与与细胞通讯、分化和发育有关的多种生理过程。此外，在一些病理过程中发现了外泌体的参与。例如，肿瘤来源的外泌体与肿瘤的发生、侵袭、转移和耐药有关。肿瘤来源的外泌体也在液体活检中得到越来越多的关注，与循环肿瘤细胞相比具有绝对的数量优势，并且能比游离核酸检测提供更多的信息。此外，外泌体表面表达的蛋白质与来源肿瘤有密切关系，并且可能反映出丰富的生物学信息，可对肿瘤进行有效治疗。例如，重要的免疫检查点分子程序性死亡配体1(PD-L1)在源自乳腺癌的外泌体上表达。PD-L1阳性(PD-L1+)外泌体的水平可能是抗PD-1免疫疗法的预后预测指标，可能对癌症治疗至关重要。然而，在乳腺癌中，PD-L1+外泌体水平的测定仍然具有挑战性，这主要是由于用于精确鉴定PD-L1+外泌体的生物传感方法的限制。

　　金属有机框架材料(MOF)是目前用于生物传感应用的非常具吸引力的多孔纳米材料。与其他现有纳米材料相比，纳米级无机-有机杂化材料表现出很多独特的优势，包括具有多种功能的可调节结构和表面功能化，具有高负载能力的大孔体积，以及适用于体内运输、可生物降解且生物相容。在生物矿化作用下，生物分子(例如生物大分子和细胞)被封装到MOF中，因此MOF可应用在核酸和蛋白质的细胞内递送中。更有趣的是，MOF的分解可以通过不同的内源性或外源性刺激来调节，例如pH、离子、温度、压力、氧化还原和磁场。例如，已知的一种典型的MOF分子型为沸石咪唑骨架ZIF-8，具有pH响应能力，在酸性环境(而非中性或碱性条件)下表现出更高的释放效率。通过生物矿化促进方法制备的蛋白质包封ZIF-8能够通过内溶酶体实现pH响应释放天然活性蛋白。同时，DNA聚合酶催化核苷酸掺入DNA链，在核酸扩增过程中促进质子从DNA链的3‘-羟基稳定释放，从而动态改变环境pH。因此，研究人员将DNA扩增引起的pH变化与pH响应蛋白封装的ZIF-8相结合，开发了一种通过电化学技术准确鉴定乳腺癌中PD-L1+外泌体的生物传感方法。

　　研究人员通过将辣根过氧化物酶(HRP)封装到ZIF-8中并随后用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)进行表面包裹，制备了对pH敏感的包裹蛋白质的ZIF-8(PVP@HRP@ZIF-8)，该结构在弱碱性pH和酸性pH下会分解。通过电化学生物传感方法，可通过使用PVP@HRP@ZIF-8准确鉴定PD-L1+外泌体。PD-L1+外泌体被抗CD63的磁珠捕获，并与抗PD-L1连接的捕获探针结合。然后，使用表面附着的捕获探针作为引物进行原位超支化滚环扩增，这是一种典型的DNA扩增反应，可降低环境pH。然后PVP@HRP@ZIF-8发生降解，导致了酶的释放，可引起放大的电化学反应，从而鉴定出目标外泌体。实验结果表明，该生物传感方法对PD-L1+外泌体的鉴定是线性的，从1E+3到1E+10颗粒/mL。此外，通过使用该方法，在未稀释的乳腺癌患者(尤其是转移性乳腺癌患者)的血清样品中发现循环的PD-L1+外泌体水平升高，表明PD-L1+外泌体水平与乳腺癌的分期和疾病进展呈正相关。因此，该生物传感方法不仅对于外泌体的识别有重要的价值，而且为将来诊断和实时监测乳腺癌提供参考信息。