一种新型肝细胞癌EV纯化分析系统用于早期HCC检测

　　近日，外泌体实验团队，开发了一种肝细胞癌细胞外囊泡(HCC EV)纯化系统——EV Click芯片。该系统协同整合共价化学介导的EV捕获/释放、多标记抗体混合物、纳米结构底物和微流体混沌混合器。使用158例HCC患者和对照组的血浆样本探索了EV Click芯片的转化应用潜力。对纯化的HCC EV进行逆转录液滴数字PCR，定量了10种HCC特异性mRNA标记并计算数字评分。HCC EV衍生的分子标记展现出对具有潜在的危险性肝硬化患者无创早期检测HCC的巨大潜力，特征曲线下的面积为0.93(95%CI，0.86至1.00;灵敏度=94.4%，特异性=88.5%)。

　　肝细胞癌(HCC)是全球癌症相关死亡的第四大常见原因。肝癌的预后不良可归因于这样的事实——通常在疾病发展的晚期才得到诊断。早期发现HCC对于降低高HCC死亡率至关重要，因为可以使用可能的治疗性干预措施来治疗早期HCC。目前，美国肝病研究协会(AASLD)指南建议对有肝硬化风险的患者进行两年一次的肝超声检查，包括或不包括血清甲胎蛋白(AFP)。然而，超声对早期病变的敏感性不足，据报道，AFP的表现差异很大。因此，开发早期HCC的非侵入性诊断方法可能会非常大地使处于发展HCC风险中的肝硬化患者受益。

　　在肿瘤学背景下的三种常规液体活检方法中，即循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤DNA(ctDNA)和细胞外囊泡(EV)，EV在疾病的相对早期阶段处于循环中，并且在所有疾病阶段都持续存在。此外，EV的固有稳定性保证了生物分子货物的完整性。因此，源自肿瘤的EV可被视为“生物标志物储库” ，有望用于无创性癌症诊断的下游分子分析。但是，传统的EV分离方法(例如，超速离心、沉淀处理和微流体富集)基于EV的物理特性(密度、溶解度或大小)，无法从总EV中分离得到肿瘤EV。由于循环中的大多数EV并非起源于肿瘤，因此高背景噪声限制了EV分析用于诊断。

　　为了克服这个问题，该研究小组和其他研究团队一直在探索各种基于免疫亲和力的方法来纯化肿瘤来源的EV。同时，其他人也在研究EV及其mRNA成分在HCC检测中的潜力。该研究小组设想，可以通过(i)使用多标记鸡尾酒开发快速有效的HCC EV纯化系统，以识别、富集和回收从高度异质HCC分泌的HCC EV来实现更灵敏、更特异的HCC EV;(ii)结合下游分子谱分析以获得能够将早期HCC与高危肝硬化患者区分开的HCC EV衍生的mRNA特征。

　　肝细胞癌细胞外囊泡(HCC EVs)的纯化和分析

　　该研究通过协同整合四种强大的方法，包括共价化学介导的EV捕获/释放、多标记抗体混合、纳米结构的底物和微流体混沌混合器，开发了HCC EV纯化系统(即EV Click Chips，上图)，为实施早期HCC的无创检测铺平了道路。共价化学介导的EV捕获/释放是基于点击化学介导的EV捕获和二硫键断裂驱动的EV释放的结合使用，以及针对三个HCC相关表面标记物(包括EpCAM、ASGPR1和CD147)的优化的多标记混合物。此外，密集封装的硅纳米线基板(SiNWS)的结合大大增加了与EV接触/交互的设备表面积。此外，由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成的微流体混沌混合器可促进SiNWS与流过的HCC EV之间的反复物理接触，从而进一步提高了EV捕获的性能。与先前的抗体介导的EV捕获相反，一对高反应性点击化学图案，即四嗪(Tz)和反式环辛烯(TCO)，被嫁接到EV捕获基质(即SiNWS，通过表面修饰)和HCC EV (通过TCO-捕获剂结合)。随后，Tz接枝的SiNWS和TCO接枝的HCC EV之间的点击化学反应迅速、特异、不可逆且呈生物正交性，从而导致HCC EV的固定化，从而提高了捕获效率并降低了背景。点击化学介导的HCC EV捕获后，暴露于二硫键裂解剂1,4-二硫苏糖醇(DTT)可通过破坏嵌入的二硫键使SiCC中的HCC EV迅速释放。

　　认识到迫切需要实用的方法来定量评估任何给定的EV纯化系统的性能(EV回收率和回收纯度)，因此该团队率先提出了一种用于评估EV Click Chip性能的定量评估方法。通过在整个优化过程中采用这种定量方法，能够准确地确定EV Click芯片的性能，从而获得非常好的HCC EV纯化条件，随后将其用于临床前研究。为了朝着非侵入性HCC筛查的方向发展，研究了简化的基于HCC EV的mRNA分析的潜力，该方法结合了用于纯化HCC EV的EV Click芯片和用于定量HCC-特异的mRNA转录本的逆转录液滴数字PCR(RT-ddPCR)，使用HCC患者和对照人群的血浆样品检测。HCC EV衍生的10个基因的分子标记显示了从高危肝硬化患者无创早期检测HCC的巨大潜力。