组织中细胞外囊泡亚群的分离和鉴定

　　细胞外囊泡(EVs)是细胞释放的脂质双层膜结构。多数EV研究是通过使用细胞系或体液进行的，但是组织衍生EV的研究数量仍然有限。外泌体试验的科研人员提出了一种protocol，可直接从组织中分离出多达六个不同的EV亚群。

　　该方法包括对解离的组织进行酶处理，然后进行差速离心和密度梯度分离。分离的EV亚群的特征通过电子显微镜和RNA谱进行表征。此外，它们的蛋白质成分可以通过质谱、蛋白质印迹等确定。组织EV分离可以在22小时内完成，简化版本可以在8小时内完成。该protocol的大多数实验都使用了人类黑色素瘤组织，但可以应用于其他癌症和非癌组织。具有细胞培养和EV分离经验的研究人员可以采用该protocol。

　　组织EV亚群分离和鉴定方法的概览

　　为了分离包埋在细胞外基质中的EV，可通过结合使用剪切和酶消化将EV从组织结构中分离出来(步骤2-16)。EV分离通过使用差速离心，然后加碘克沙醇密度梯度(步骤25–39A)来进行。

　　简而言之，收集后，将组织保持在冰上的PBS中，然后立即处理以进行EV分离(步骤1)。先将其切成小块(~2×2×2mm)，再加胶原酶D和DNase I在37°C温和搅拌，在混合器上以24 rpm的速度温和搅拌30分钟(步骤2-16)。该步骤可将EV从其所包裹的组织中分离出来。采用孔径为0.70 µm的过滤器进行过滤，以除去大的组织块、颗粒等(步骤17-24)。

　　剩余的液体分别在300g和2000g离心20分钟，以去除细胞和组织碎片(步骤25-28)。然后将上清液进一步以16,500g离心20分钟以收集大型EV(lEV)的粗馏分，并以118,000g离心2.5 h以收集小型EV(sEV)的粗馏分(步骤29-38)。两种类型的EV可以用于下游分析，也可以进一步处理以分离EV的亚群。

　　为了进行进一步处理，将lEV和sEV加载到各个碘克沙醇密度梯度(OptiPrep)上。粗制EV溶解在60%(wt / vol)的OptiPrep中，并在顶部放置不连续的碘克沙醇梯度(35%，30%，28%，24%，22%×2和20%(wt / vol)的OptiPrep)(步骤39A(i-vii))。以186,000g离心16小时后，总共收集了四个亚群EV(步骤39A(viii-xiv))。从20–22%(wt/vol)的碘克沙醇(~1.111–1.121g/cm3)界面可收集两个EV亚群——大的低密度(LD)EV和小的低密度(LD)EV，从30–35%(wt/vol)碘克沙醇层(~1.163–1.189g/cm3)的界面可收集另外两个EV亚群——大的高密度(HD)EV和小的高密度(HD)EV。

　　可以使用多种方法来进行EV表征，以评估EV大小、浓度、分子特性和货物。该文演示如何从人类转移性黑色素瘤中分离出EV，并通过TEM(步骤40A)、RNA谱分析(步骤40B)。此外，还描述了如何进行蛋白质组学分析(步骤40D)和蛋白质印迹(步骤40E)。

　　为了减少执行整个组织EV分离方案所需的时间，可以应用另一种较短的方案，包括碘克沙醇密度垫作为不连续密度梯度的替代品。该替代方案仍然产生与可溶性蛋白质分离的高纯度EV，但是lEVs and sEVs被装载在相同的密度垫上，因此作为混合物被分离。简而言之，将lEV和sEV的粗馏分混合在一起，并重悬于60%(wt / vol)的OptiPrep中(步骤39B(i-ii))。在样品的顶部放置两层30%和10%(wt / vol)OptiPrep(步骤39B(iii-v))。在186,000g离心2.5小时后，从10%和30%(wt / vol)碘克沙醇层的界面收集EV(步骤39B(xi))，并用TEM表征(步骤40A)。在10%和30%(wt / vol)碘克沙醇之间的界面处发现了lEV和sEV(，而仅可见少量囊泡在30%至60%(wt / vol)碘克沙醇界面处的非囊泡成分中。