siRNA合成可以通过哪些方法?每种方法又是如何实现的?

　　在生物实验中，我们需要合成siRNA。那么，siRNA合成可以通过哪些方法?每种方法又是如何实现的?我们常用的方法有五种，下面，我们就来仔细为大家介绍一下。希望给大家提供一定的参考!

　　siRNA合成的方法主要包括：

　　1、化学合成

　　2、体外转录

　　3、长片断dsrna经rnaseiii类降解。

　　4、siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs

　　5、pcr制备的siRNA表达框在细胞中表达

　　前三种方法主要都是体外制备siRNAs，并且需要专门的rna转染试剂将siRNAs转到细胞内。后两种方法的优点在于不需要直接操作rna，依赖能够表达siRNAs的dna载体或者表达框转染到细胞中。每种方法都有有缺点，具体那种方法取决于试验目的。

　　一、化学合成siRNA分子：

　　尽管化学合成是比较贵的方法，但是却是方便的。研究人员几乎不需要做什么工作。生物公司可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格相对来说比其他方法高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3-4对siRNAs的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出有效的序列再进行化学合成。

　　适用于：已经找到有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究

　　不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素

　　二、体外转录合成siRNA分子：

　　通过体外转录的方法可以合成siRNAs，这样的成本相对化学合成法而言比较低，是一种性价比高的筛选siRNAs的好方法。更重要的是采用这种方法能够比化学合成法更快的得到siRNAs。这个方法的不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。毕竟，化学合成只需要定购就可以了。值得一提的是体外转录得到的siRNAs只要较低的浓度就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果。

　　优点：体外转录得到的siRNA毒性小，稳定性好，效率高。达到同样的转染效率只需要化学合成量的1/10。

　　适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。

　　不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA，长期研究。

　　三、用rnase iii 消化长片断dsrna制备siRNA：

　　其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。这个方法是选择通常是200-1000碱基的靶mrna模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsrna ，然后用rnase iii (or dicer) 在体外消化，得到一众siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsrna后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。dsrna消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱(注意：通常用rnase iii通常比用dicer要便宜)。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。优点：①有很高的有效性。②可跳过检测和筛选有效siRNA序列步骤，节省时间和金钱。

　　缺点：可引发非特异的基因沉默，特别是同源或密切相关的基因。

　　适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型

　　不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗

　　四、siRNA表达载体：

　　多数的siRNA表达载体依赖3种rna聚合酶iii 启动子中的一种，操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。这3类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的u6启动子和人h1启动子。之所以采用rna pol iii启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子rna，而且它是通过添加一串(3到6个)u来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹rna序列的dna单链，退火，克隆到相应载体的pol iii 启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几天的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。不过幸好载体容易大量扩增，这个优点足以弥补所有缺陷，特别是当载体在实验中确实有效的时候。如果您选择shrna，有报道显示9个寡核苷酸的环是有效的。此法需首先化学合成一段编码siRNA 正义和反义链的模板, 正义与反义序列之间由一段环(loop) 序列隔开, 插入载体pol ⅲ启动子下游, 然后转入细胞,环序列可使转录出的rna 链折叠成具发夹结构的小rna 分子, 这些小rna 可被细胞内的dicer 切割为长21bp 的siRNA 有19 对互补碱基, 3'端各有2 个u 突出, 可引起特定基因沉默。与化学合成及体外酶法合成相比, 表达载体是在细胞内通过转录持续产生siRNA , 所以可延长siRNA 作用时间, 目前此法已被广泛应用。

　　优点：可进行较长期研究，带有抗生素标记的载体可在细胞中持续抑制靶基因的表达。

　　适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默，或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞。长期研究。

　　不适用于：筛选siRNA序列(其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作)

　　五、siRNA表达框架：

　　siRNA表达框架是一种由pcr得到的siRNA表达模版，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。这个方法早是由castanotto和其同事采用，包括一个rna pol iii启动子，一段发夹结构siRNA，一个rna pol iii终止位点。和siRNA表达载体不同的是，secs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由pcr得到，不用一天的时间。因此，secs成为筛选siRNA的有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的搭配!如果在pcr两端添加酶切位点，那么通过secs筛选出的有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。

　　这个方法的主要缺点是pcr产物很难转染到细胞中。如果有适合的新型转染试剂能提高sec的转染效率的话，那问题就可以解决了。另外，没有克隆到载体中的pcr片断并不适于大规模制备。

　　优点：无需载体克隆测序，是有效的筛选siRNA工具，甚至可用以筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA搭配。

　　缺点：pcr产物比较难转染到细胞中。如果有适合的新型转染试剂能提高sec的转染效率的话，那可以解决很大问题。另外，不能进行序列测定，pcr和dna合成时可能差生的误读不能被发现，可能会因此导致结果不理想

　　缺点：①pcr产物很难转染到细胞中，②不能进行序列测定，pcr和dna合成时可能产生的误读不能被发现导致结果不理想。

　　适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选启动子。

　　不适用于：长期抑制研究。