Cas9载体构建

一、服务简介:

CRISPR/Cas9 是一种能够对基因组的特定位点进行精确编辑的技术。其原理是核酸内切酶Cas9蛋白通过导向性RNA(guide RNA, gRNA)识别特定基因组位点并对双链DNA进行切割,细胞随之利用非同源末端连接(Non homologous End Joining,NHEJ)或者同源重组(Homologous Recombination, HR)方式对切割位点进行修复,实现DNA水平基因敲除或精确编辑。


二、服务内容:

1. CRISPR基因敲除

利用CRISPR / Cas9 进行单基因敲除

目前研究最透彻、应用最广泛的II 型-CRISPR/Cas9 系统由两部分组成:

1. 单链的guide RNA(single-guide RNA,sgRNA)

2. 有核酸内切酶活性的Cas9 蛋白

CRISPR/Cas9 系统利用sgRNA 来识别靶基因DNA,并引导Cas9 核酸内切酶剪切DNA(图1)。当基因组发生双链DNA 断裂后,细胞通过非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ) 将断裂接合,在此过程中,将随机引入N 个碱基的缺失或增加,若N 非3 的倍数,则目的基因发生移码突变,实现基因敲除。


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1 CRISPR / Cas9 KO 原理


2. CRISPR过表达

利用CRISPR / Cas9 进行单基因过表达

通过修饰CRISPR/Cas9 系统中的一些元件,形成一种蛋白复合物-协同激活介质(SAM),可实现对多数细胞内源基因的特异性激活。该系统灵活方便,为研究基因功能提供了极为便利的工具。


CRISPR-SAM 系统由三部分组成:

1. 失去核酸酶活性的dCas9(deactivated Cas9)-VP64 融合蛋白

2. 含2 个MS2 RNA adapter 的sgRNA

3. MS2-P65-HSF1 激活辅助蛋白

CRISPR-SAM 系统中的MS2-P65-HSF1 激活辅助蛋白就是SAM,全称为SynergisticActivation Mediator( 协同激活调节器),这也就是CRISPR-SAM 的命名由来。CRISPR-SAM 借助dCas9-sgRNA 的识别能力,通过MS2 与MS2adapter 的结合作用,将P65/HSF1/VP64 等(均为转录激活因子)拉拢到目的基因启动子区域,成为一种强效的选择性基因活化剂,从而增强基因的转录表达。