你提取的是外泌体吗？

在外泌体研究过程中，你都接触或者用过哪些表征鉴定方法呢？

纳米颗粒跟踪分析（NTA）、动态光散射（DLS）、纳米流式（nFCM）、扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）、冷冻透射电子显微镜（CryoTEM）、原子力显微镜（AFM）、蛋白质免疫印迹（WB）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、高通量测序（RNA, DNA）、蛋白质谱分析（Proteomics）、脂质组学分析（Lipidomics）等等，大家可以将自己用过的鉴定方法打在评论区，一起分享奥~

研究外泌体的伙伴们都知道，分离纯化得到外泌体之后，一定要进行相关的鉴定实验，为自己的外泌体提供数据支持，从而更加准确的描述自己的外泌体。获得高质量的外泌体并不容易，一是外泌体中可能混有杂质，二是分离纯化过程中的一系列操作可能破坏外泌体的结构，这都会对外泌体的品质造成影响，进而可能会影响后续实验。因此，鉴定环节必不可少。

在鉴定环节，单一方法不能够全面评估外泌体的质量。比如电镜可以看到形态，但是包括支原体、铁蛋白聚团、溶酶体等它们形态很类似； NTA是一种测算粒子群体直径分布和数量的计算方法，它靠的是粒子对光路的影响，这一方法不能反映粒子形态，无论样品是外泌体还是纳米微珠，它都会算作粒子，因此也不能区分外泌体；WB是鉴定的是外泌体的一些标志物蛋白，但是目前的这些标志物蛋白只是会在外泌体里富集，而并不是外泌体所特有的，诸如CD63、ALIX等在细胞中都有，在一些细胞碎片、溶酶体、胞内体中也大量存在。根据国际细胞外囊泡学会（International Society For Extracellular Vesicles, ISEV）的建议，鉴定外泌体要从大小、形态、表面标志物三个方面进行，因此需要三种方法共同进行相互验证。

实验中提取的外泌体大小并不一致，所以常用粒径分布对外泌体的大小进行评估，目前常用纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）对外泌体粒径分布进行检测。纳米颗粒跟踪分析（NTA）的原理是，用激光照射样本中的纳米颗粒，高速相机拍照记录每个纳米颗粒的散射光点，获得其布朗运动的轨迹，再根据Stokes-Einstein方程计算纳米颗粒的粒径（流体力学粒径）。同时，统计视频窗口内的颗粒数量并计算浓度。通常，纯度较高的外泌体NTA检测结果呈现单峰。

对外泌体的形态进行鉴定，最直观的方式就是在显微镜下观察，透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）可以很好的获取外泌体形态信息，是目前外泌体形态鉴定最常用的方法，透射电子显微镜（TEM）分辨率高（可达0.1-0.2nm），其技术原理是将经加速和聚集的电子束投射到负染（染背景不染样品，常用四氧化锇、乙酸铀等重金属盐进行负染）后的外泌体样品上，收集透过样品的散射电子，获得单个外泌体的形貌和尺寸照片。TEM得到的外泌体图像通常呈现茶托状的圆形或椭圆形。

外泌体形成过程中，在外泌体膜表面及囊泡内部，都会携带标志性的蛋白，对这些蛋白进行检测，就能判断是否成功提取到外泌体。目前，外泌体表面标志物鉴定中常用的检测指标有CD9、CD63、CD81、TSG101、Alix等。当然还有人会选择外泌体中不携带的蛋白作为对照。关于内参的选择，在外泌体研究中并没有严格规定。因为此时WB并不用于定量，只是验证外泌体有无的一个依据。

综上所述，外泌体鉴定的思路就是，可以在电镜下看到典型的外泌体结构，粒径分布检测结果符合外泌体特征，同时检测到了外泌体标志蛋白，三者相互验证，才能充分证明提取物的确是外泌体。还要对纯化后外泌体的纯度（颗粒数/蛋白量）和囊泡比例进行分析，来进一步定义外泌体的品质。当然，除了从大小、形态、表面标志物这三个方面进行基础鉴定，还可以通过高通量测序、蛋白质谱、代谢组学分析等方法对外泌体的内含物进行全面分析。