超详细:WB 常见问题及解决方案

1. 免疫印迹

蛋白质印迹或免疫印迹 (Western blot，简称 WB) 是一种常见的实验室方法，用于检测蛋白质并评估其表达水平。根据其分子量和与特定抗体的免疫反应性来鉴定感兴趣的蛋白质。蛋白质印迹由一系列相互关联的步骤组成 (图 1)。

蛋白质印迹相互关联步骤：

(1) 将样品 (通常是蛋白质混合物) 加载到凝胶上。Marker 标记包含各种已知分子量的预标记蛋白质，与蛋白质样品一起加载到凝胶上作为尺寸参考。

(2) 凝胶电泳用于根据蛋白质的分子量来分离蛋白质。

(3) 将蛋白质转移或“印迹”到膜上。

(4) 封闭膜以减少非特异性结合，然后依次用特异性结合目标蛋白的一抗和二抗进行探测。后者结合一抗并携带允许随后检测的酶或荧光团。

(5) 分别通过化学发光反应或荧光检测信号。

(6) 准备蛋白质印迹图像以供发表。

由于该实验时间长、细节多，从样品制备到显影，每个步骤中都可能存在问题，最后得到的条带往往千奇百怪、不尽人意……在这篇推文中，我们将为您介绍一些常见的 WB 实验问题以及相应的解决方案。

2. 免疫印迹常见问题及解决方案

2.1 问题一：背景高

2.2 问题二：信号弱或完全缺失

2.3 问题三：出现“非特异性”条带、多带等现象

2.4 其他问题

2.4.1. 微笑条带：

可能性原因：迁移过快、电泳缓冲液温度偏高、蛋白质超载或孔内运行缓冲液不足。
建议：应降低迁移速度、预冷缓冲液、减少蛋白上样量、缓冲液完全覆盖孔，确保内室缓冲液不会泄露到外室[4][6]。

2.4.2. 皱眉条带：

可能性原因：装置不合适，可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。

建议：可通过调整装置来避免该问题。

2.4.3. 条带拖尾：

可能性原因：样品溶解不好；存在一定程度地蛋白降解；电泳液反复多次使用。

建议：样品充分溶解混匀后上样；尽量使用新鲜样本；使用新鲜配制的电泳缓冲液。

2.4.4. 哑铃状不均匀条带：

可能性原因：配置胶有问题，胶凝固后不均一；样品可能含有过多杂质。建议：重新配置胶，确保胶质量无问题来避免该现象出现；在样品使用前离心。

2.4.5. 条带粘连：

可能性原因：可能是上样量太多，或者是制胶问题，分离胶和浓缩胶之间有间隙，样品窜孔。建议：可通过减少上样量和提高配胶质量来避免。

2.4.6. 条带空泡：

可能性原因：转膜时膜上有气泡建议：确保在组装“三明治”时，移除凝胶和印迹膜间的所有气泡。

2.4.7. 背景有不均匀的黑色斑点：

可能性原因：封闭液未完全溶解，使不容颗粒附着在膜上从而导致发光时候膜上形成黑点；或抗体在膜上分布不均；

建议：封闭液一定要充分溶解，封闭结束之后要用 TBST清洗三遍再加一抗；抗体孵育时保持摇动。

2.4.8. 条带空斑：

可能性原因：目的蛋白条带中间空白，周围背景正常。该现象可能是一抗二抗浓度过高，促使底物过快消耗，从而导致在进行化学发光时，底物耗尽形成空斑。